３．ウイルス性食中毒原因の遺伝子検査標準法確立と全国行政対応整備に関する研究

（厚生科学特別研究事業　研究期間　1997-1999年度）

主任研究者： 川本尋義（岐阜県生物産業技術研究所） 研究分担者： 沢田春美(北海道立衛生研究所)、斎藤博之(秋田県衛生科学研究所)、三上稔之(青森県環境保健センター)、秋山和夫(宮城県保健環境センター)、篠川 旦(新潟県衛生公害研究所)、関根大正・矢野一好(東京都立衛生研究所)、野口有三(横浜市衛生研究所)、杉枝正明(静岡県衛生環境センター)、柴田伸一郎(名古屋市衛生研究所)、山下照夫(愛知県衛生研究所)、松本和男(福井県衛生研究所)、春木孝祐(大阪市立環境科学研究所)、山崎謙治(大阪府立公衆衛生研究所)、池田義文(広島市衛生研究所)、大瀬戸光明(愛媛県立衛生研究所)、大津隆一(福岡県保健環境研究所)、大野惇(沖縄県衛生環境研究所)、宇田川悦子(国立感染症研究所)、西尾浩（国立公衆衛生院)、大山徹（東京農業大学)、大垣眞一郎（東京大学） 以上は「厚生科学全国ウイルス性食中毒研究班」と称す。

【目的】　当班研究目標の第１は国内ウイルス性食中毒遺伝子診断（ＲＴ−ＰＣＲ）法確立、第２は国内のウイルス性食中毒の分子疫学的実態解明、第３は食品衛生行政推進のため体制整備に向け施策提言を行い、第４に環境・食品ウイルス汚染制御を目指しSRSVの国内生態・動態を把握するべく断面調査を行い、次世代の環境・食品安全制御技術の研究開発へ展開させることにある。

【方法】　「食品を介した健康被害」即ち食中毒に対する行政の円滑対応を図るため、食中毒遺伝子検査技術の確立と整備について研究者は連携強化を図り、国内ブロック（北海道、東北、関東甲信越、中部、中国、四国、九州、沖縄）の拠点にてウイルス性食中毒患者、食品、環境試料等からの小型球形ウイルス（SRSV）遺伝子検出効率向上と確立を目指し、分子疫学解析を行い食品衛生行政対策に資すると共に内外学会、学術誌に成果を公開し厚生科学研究事業総括報告書を発刊する。

【結果および考察】
１．ＲＴ−ＰＣＲ法改良　効率の良い核酸抽出市販キットも導入しＲＴ−ＰＣＲ法術式の無駄を省き簡素省力化（逆転写とＰＣＲ増幅も同一管内反応とするなど）を図り改良法提案と普及に努め、同時に国内ウイルス性食中毒の分子疫学解析へ以下応用を図った。
（１）遺伝子抽出に市販キットを積極的導入し効率性と有害廃棄物対策を実施
（２）ＲＴ−ＰＣＲでは逆転写（ＲＴ）と遺伝子連鎖増幅（ＰＣＲ）は別個反応系で、ネステッ
　　　ドＰＣＲは実施しない方がよい。検出過程で核酸汚染を懸念
（３）国内SRSV診断用ユニバーサルプライマーの独自設計
　　　米国ノーウォーク・ウイルスを代表とするSRSV遺伝子型群Ｇ１、スノーマウンテン、メキシコ、トロント・ウイルスを代表とするＧ２の国外株からＯＲＦ１共有塩基配列をもとに診断用プライマー（当班提案は厚生省検査指針平成９年１月付通知）を設計した。しかし、国内には異型Ｇ２出現傾向が高く日本固有のウイルス遺伝子群割合が全体の約５割以上あることが班研究で明らかとなった。1989年から1998年まで検出した約７千株のSRSVから200株の遺伝子配列を抽出し、ユニバーサルプライマー設計と実証試験を実施中。食中毒患者（糞便）と食品（生かき）からの検出感度が向上し、国内SRSVの遺伝子群約８割以上が検出可能となった。
２．SRSV分子疫学　当班では国内１８地域のウイルス性食中毒患者・原因推定
　　　食品等から検出された約７千株をもとにSRSV遺伝子配列決定を実施した内、約200株を選出した。このような組織的分子遺伝学的解析がSRSV研究で実施された例は内外にない。我々はこれらの188株をもとにＯＲＦ１（ＲＮＡポリメラーゼ領域）塩基配列とアミノ酸配列を比較検討した。これら独自の遺伝子情報をもとに、ウイルス系統樹比較解析を行い、SRSV検査用ユニバーサルプライマーを設計した。その検出効率とその向上は平成１１年度現在もなお検証中であるが、汎用SRSV診断検査用日本独自のユニバーサルプライマー設計をほぼ完了した。それら有用性と検出効率の検証が終了次第、遺伝子情報の開示を行う予定である。SRSV遺伝子配列解析から国内株はおおよそ２種の遺伝子群型に分別されるが、特にＧ２に５種の群型内亜型が存在することも明らかとなった。新亜型の１つはＧ２代表株であるスノーマウントやトロント、メキシコとも特徴が異なり新種群として我々は暫定的にＪＰＮ−１とした。他の１つは由利株で代表される特異なＧ２の種で、これは限られた年度で短期に出現したことが明らかとなった。われわれはこの由利型Ｇ２をＪＰＮ−２と名付けた。国内SRSV分布は、Ｇ２／ＪＰＮ−１》Ｇ２／ＪＰＮ−２》Ｇ１／ＮＶＬの出現頻度でＧ１／ＮＬＶは全体の１割程度であった。

　以上のSRSV遺伝子解析と分子疫学の結果、我々は独自に新規汎用診断ユニバーサルプライマーを設計せねばならなかった。ＲＴ?ＰＣＲ法改良とその普及、国内SRSV食中毒の分子疫学成果は必ずや食品衛生行政の推進と全国対応整備に役立つものと確信する。